地肤子系藜科草本植物地肤的成熟干果，具备清热、止痒、利尿的效果，临床用于治疗尿急、小便涩痛、皮肤瘙痒、荨麻疹和湿疹等[1]。研究报道主要含有三萜、三萜皂苷和黄酮等化学成分[2-5]。近来研究表明地肤子也具有一定降血糖作用，原因可能是地肤子正丁醇提取物中总皂苷含量较高，可以抑制糖分在胃肠道的转运、转化和吸收[6-7]。同时地肤子中所含的黄酮类化合物含有多个羟基，具有较好的生物活性，可有效清除体内自由基，对抗糖尿病高血糖所致的氧化应激反应，阻止蛋白质和核酸等大分子物质免受损害，保护正常细胞结构和功能。对预防和减少糖尿病并发症有一定益处[8-9]。故作者推测地肤子提取物可能会在抑制α- 葡萄糖苷酶方面具备一定的效应，通过文献调研国内外尚未见地肤子对于α- 葡萄糖苷酶具有抑制效应的相关报道。

临床上，阿卡波糖是使用最多的抑制α- 葡萄糖苷酶药物，其优点是副作用小，可与其他降糖药物配伍用于治疗I 型和II 型糖尿病，因此研究新的α- 葡萄糖苷酶抑制药已是药物研究的一大课题[10]。目前研究报道集中在天然植物里筛选新型的α- 葡萄糖苷酶抑制剂[11-13]。本次研究地肤子提取物对于α- 葡萄糖苷酶所体现的抑制效应，同时利用抑制动力学试验确定酶活性抑制类别，从而为开发利用地肤奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

2019年11月采集地肤子于河南省郑州市郊区，由郑州铁路职业技术学院药学院张晓霞副教授鉴定。

α- 葡萄糖苷酶产自百灵威科技有限公司，阿卡波糖( 即acarbose) 产自上海源叶生物科技有限公司。其余化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器

多功能酶标仪（Biotek synergy LX 型），E-2000B 型旋转蒸发仪、RDLSB 型低温冷却循环泵（郑州亚荣仪器有限公司），SHB- Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

2 方 法

2.1 地肤子提取物的制备

将采集的样品置烘箱中于45℃烘干12 h。烘干后取200 g 粉碎，过60 目筛，用10 倍量75%乙醇冷浸，24 h 内定时搅拌，再静置48 h，共浸提3 次。合并滤液后减压浓缩。浓缩液在水里混悬着，依次采取有机溶剂石油醚、乙酸乙酯及正丁醇对其加以萃取，将萃取液降压、浓缩，经过干燥处理之后，以DMSO 将获取的浸膏配成不同浓度的溶液后使用。将阿卡波糖配制成和样品一样的浓度梯度，以作阳性对照。

2.2 PNP 标准曲线的绘制

精确称取0.007 1 g PNP标准品，用pH6.8 磷 酸盐缓冲溶液（0.1 mol/L）超声溶解，定容至50 mL 母液，随后将母液稀释成0、25、50、100、200、300、500 μmol/L。 取160 μL 的PNP溶液，加入80 μL 的0.2 mol/L Na2CO3溶液，混匀后，在405 nm 下检测吸光度A 值，平行测定3 次，取平均值。每种浓度依法测定，绘制标准曲线，横坐标是PNP 浓度，纵坐标是吸光度值A。

2.3 地肤子提取物抑酶活性试验

地肤子提取物抑酶活性试验参照宋昱等[14]操作方法：取α-葡萄糖苷酶20 μL 0.2 U/mL， 加 入112 μL pH=6.8 的磷酸盐缓冲溶液（0.1 mol/L）和8 μL 的DMSO，37 ℃水浴锅中保持恒温15 min，放进20 μL PNPG 2.5 mmol/L，在37 ℃下反应15 min，反应结束后，加入80 μL Na2CO3的溶液0.2 mol/L。室温405 nm 波长下测量吸光度A 值。

样品测定组吸光度为A1。样品对照组是将酶液用PBS 替代测定得到的吸光度A2。空白组是不加入样品测定得到的吸光度A3。空白对照组是不加入样品同时酶液用PBS 替代测定得到的吸光度A4。阳性对照组选用α-葡萄糖苷酶抑制药阿卡波糖。抑酶活性曲线以样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率为纵坐标，样品的质量浓度为横坐标，算出地肤子各提取物的半抑制浓度（IC 50）。

抑制率=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100%

表1 地肤子提取物抑制α-葡萄糖苷酶活性试验的检测办法组别 酶液 PBS 样品 DMSO PNPG Na2CO3样品测定组 20 112 8 0 20 80样品对照组 0 132 8 0 20 80空白组 20 112 0 8 20 80空白对照组 0 132 0 8 20 80阳性对照组 20 112 8 0 20 80

2.4 地肤子提取物对于α-葡萄糖苷酶抑制类型的动力学探讨

依次确定地肤子乙酸乙酯相和正丁醇相的浓度，二者互不相同，分别加入0.625、1.25、2.5、5、10 mmol/L 五种浓度的PNPG 底物溶液, 根据2.3 法分别测定反应速率。根据Lineweave-Burk 双倒数作图法，以底物PNPG 浓度的倒数为横坐标，反应速率的倒数为纵坐标，分别绘制地肤子乙酸乙酯相和正丁醇相抑酶动力曲线。地肤子不同提取物的抑制类型依据酶抑制效应动力学曲线图的形状确定[15]。